大肠杆菌的作用
撰文 | Qi
责编 | 兮
了解基因功能是分子生物学的主要目标之一。质谱法可以观察整个蛋白质组，当与传统工具如亲和纯化或排阻色谱结合时，可以直接检测蛋白质-蛋白质的相互作用，虽然功能强大，但这些方法是在细胞裂解后进行的，会改变蛋白质原始环境以及结合能力【1,2】。近年来高通量反向遗传学（high-throughput reverse genetics）的发展彻底改变了我们绘制基因图谱的能力，尤其是热蛋白质组分析（thermal proteome profling, TPP），它将细胞热移测定（cellular thermal shift assay， CETSA）与多重定量蛋白质组学相结合，可以深入了解蛋白质的原位状态，反映特定蛋白质与代谢物，其他蛋白质以及和核酸等的相互作用【3,4】。
2020年12月9日，来自德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Athanasios Typas课题组和Mikhail M. Savitski课题组在Nature杂志上合作发表一篇题为 The functional proteome landscape of Escherichia coli 的文章，在这项研究中，作者结合反向遗传学和热蛋白质组分析描述大肠杆菌中的遗传扰动对蛋白质丰度和热稳定性的影响，为推断蛋白质功能和相互作用提供了丰富的资源。
首先，作者对121株大肠杆菌（大多数是来自Keio library的单基因缺失突变体）完成二维热蛋白质组分析（2D-TPP），利用化学遗传学数据以选择突变体来干扰不同的细胞过程。每一个突变体生长至指数阶段，加热至10个不同温度以诱导蛋白质变性，随后在每个温度下进行细胞裂解并收集可溶性蛋白质部分，产生的蛋白样品通过串联质谱和定量蛋白质组学进行测定分析。在这个过程中作者建立了蛋白质丰度和热稳定性变化的综合数据集，鉴定出近70%的蛋白质在至少一次扰动中发生改变，且丰度和热稳定性基本上是正交的。
图1. 热蛋白质组分析的实验流程示意图
由于必需基因（essential genes）的功能很难用遗传学方法来研究，作者探讨了必需基因如何在遗传扰动中表现。结果显示，由必需基因编码的蛋白质通常丰度更高，但其丰度变化的频率低于非必需基因编码的蛋白质，此外必需蛋白质比非必需蛋白质更容易受到热稳定性的影响，这提示它们的活性或相互作用可能在某些遗传背景下受到调节。接下来，为了深入了解必需蛋白质热稳定性变化的后果，作者使用CRISPRi降低不同遗传背景下FtsK（一种细胞分裂DNA移位酶）和ParC（拓扑异构酶IV的亚基）的水平，仅轻微影响野生型细胞的生长，然而细胞不能耐受在热稳定性受到影响的突变体中必需蛋白的消耗。这些数据提示细胞可以维持高水平的必需蛋白以缓冲它们在不同条件下的活性变化，这种必需和非必需基因的合成致死性可以为组合药物治疗提供新的途径。
随后，作者通过计算所斯皮尔曼等级相关系数来评估在不同温度下121个遗传扰动中哪些蛋白对的共同改变。需要注意的是，本研究测定的蛋白质热稳定性能力能够进一步捕捉蛋白间的功能关联，例如RNA聚合酶的核心亚单位（RNAP；RpoA，RpoB和RpoC）之间的相关性更多是由于高温引起的改变，尽管目前尚不清楚如何将热稳定性与RNAP状态相关联。此外，在证实数据可重现已知生物学的基础上，对未知功能蛋白即孤儿蛋白（orphan proteins）提供新的见解，共发现140个孤儿蛋白可能与已知的生物过程相关。
由于蛋白质的热稳定性可以通过配体结合而改变，那么作者想知道描述代谢途径结构的能力是否与酶活性的变化以及代谢物水平的变化有关。为此，作者对本研究中包括的19个突变体和野生型大肠杆菌细胞中来自糖酵解和柠檬酸循环代谢物的相对水平完成量化，除发现代谢物水平的巨大变化之外，作者其与酶热稳定性之间存在显著相关性，但与酶丰度无关。这些数据提示，酶的热稳定性可以反映作为底物或产物与酶直接相互作用的细胞内代谢物的水平。因此，TPP捕捉体内的酶活性，为细胞的代谢状态和产生代谢途径关联的能力提供了一个独特的视角。
最后，作者想知道蛋白质组的变化是否能解释突变体在不同化学和环境胁迫下的生长表型。为此，利用来自化学遗传学的数据集，将所有突变背景下检测到的每个蛋白质的蛋白质丰度或热稳定性与相同突变体在所有化学遗传条件下的适应性相关联，提供了不能单纯通过基因缺失解释的生长表型的新见解。
总的来说，这项研究系统地测定了121个大肠杆菌突变体中近1800个蛋白质的丰度和热稳定性，并确定了10000多种潜在的新相互作用，其中也有部分涉及未知功能的孤儿蛋白。作者发现蛋白质的热稳定性会直接受到结合蛋白的辅因子和代谢物水平的影响，提供了一种测量代谢活动的方法。最后，作者将本研究数据与现有大规模表型数据相结合，以获得跳出敲除基因本身的条件生长表型原因的新见解，为成千上万具有因果关系的蛋白质-表型联系打下基础。综上所述，本研究提供的数据集可用于深入了解蛋白质的功能和关联性，并且这种方法可以扩展应用于其他生物体。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-020-3002-5
制版人：十一
参考文献
1. Babu, M. et al. Global landscape of cell envelope protein complexes in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 36, 103–112 (2018).
2. Wan, C. et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature 525, 339–344 (2015).
3. Martinez Molina, D. et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science 341, 84–87 (2013).
4. Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M. & Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Anal. Bioanal. Chem. 404, 939–965 (2012).
